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使用基于質譜的蛋白質組學研究人類疾病

您在Walter and Eliza Hall Institute實驗室的重點領域是什么?

我們是澳大利亞領先的醫學研究所之一。我經營蛋白質組平臺技術實驗室。作為一家研究所,我們的大部分研究都集中在癌癥,免疫失調和傳染病上。但是,最近,我們的研究重點已經發展到健康的發展和衰老。該研究所擁有93個實驗室,擁有1000多名員工,涵蓋多種疾病。員工人數意味著我們必須具有相當高的吞吐量。擁有這么多員工,考慮我們的基礎架構以及如何最大程度地提高產出非常重要。

隨著時間的流逝,實驗室中出現的一件事是我們需要檢測蛋白形式。考慮翻譯后修飾(PTM)和其他翻譯后作用時存在的蛋白質形式。

我們投入大量資金來了解蛋白形式的生理作用并開發技術以更好地檢測它們。目前,我們正在使用質譜儀,但我們知道我們只是在看到冰山一角。盡管這些儀器非常靈敏,但動態范圍是主要的限制因素,因為我們知道,細胞內以及我們分析的許多生物流體內存在的動態范圍遠大于我們可以檢測到的范圍。

為什么理解翻譯后修飾(PTM)的影響為何很重要?

大多數醫學研究實驗室使用自下而上的蛋白質組學,并且通常專注于以基因為中心的方式(蛋白質堿基定量)使用蛋白質組學。在我們的實驗室中,由于我們與許多細胞信號轉導基團一起工作,因此與我們合作的許多蛋白質都在翻譯后進行了修飾,因此對我們監測不同條件下的這些PTM變化非常重要。我們通常在蛋白質的背景下考慮PTM,這種蛋白質體現在“蛋白形式”的概念中,在這里我們真正對化學修飾的基因產物的功能版本感興趣的分子。

我們可以檢測到在給定的時間點在任何細胞中表達的大約11,000至13,000個基因產物,翻譯后修飾可以通過RNA編輯或編碼不同的SNP,轉錄調控,是否被截短,被蛋白酶切割,或化學修飾,例如磷酸化。還存在超過107種已知的內源性翻譯后修飾。這些蛋白質樣品中可能存在的復雜性是天文數字。話雖如此,我預計在任何時間點,給定細胞的蛋白形式可能約為1000萬。

在我的實驗室中,我們的目標是深入研究并盡可能多地關注這些基于PTM的蛋白形式。如果我們能夠進行非常深入的測量,我相信我們可以開始將翻譯后修飾的蛋白質與某些表型相關聯。這與了解為什么我們看到表型有所不同就近了。

分析蛋白形式的最佳方法是什么?

分析這些蛋白形式和可能存在的不同形式蛋白質的最佳方法之一是分析完整蛋白質。幾年前,當我們開發出一種以非常高的通量和高效的方式凈化蛋白質的方法時,便致力于此工作。

我們使用順磁珠作為成核劑來沉淀我們的蛋白形式。如果您熟悉基于樹脂的SP3方法,則可以采用這種方法,但是需要額外的洗脫步驟。為此,我們從蛋白質聚集領域獲得了一些知識,并結合了甲酸以非常有效且無偏的方式提取純化的蛋白質。當您這樣做時,最終會得到一種非常健壯且高度可重復的釋放完整蛋白質以進行MS分析的方法。

來自LC分離的MS1信號提供了我們可以在單個shot彈槍中檢測到的所有完整蛋白質的量度。平均而言,單次拍攝即可檢測到大約2,000種不同形式的蛋白質,揭示出令人難以置信的基因產物異質性陣列。

我們發現,平均而言,蛋白質以大約八種不同形式(PTM形式)存在。由此,當使用自下而上的蛋白質組學時,我們知道我們正在尋找的是這是真正存在的蛋白質的冰山一角。我們知道蛋白質形式內的功能異質性要比我們目前在該領域中了解的多得多。

如果有辦法更深入地研究這一點,那就太好了!我們知道,這僅僅是個開始,因為當您考慮分析完整的蛋白質時,信號強度通過同位素和電荷狀態分布非常分散,這意味著我們的動態范圍有限,并且我們對深層挖掘的能力有嚴格的限制使用這種方法進入蛋白質組。

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